FORSCHUNG
E. COLI
Antimikrobielle Aktivität von Constructive Microbes gegen das Bakterium Escherichia coli
Abschließende Schlussfolgerung
Die Constructive Microbes zeigen eine starke bakterizide Aktivität gegen Escherichia coli, die sich in einer vollständigen Inaktivierung von 99,995 – 100 % der Bakterienzellen nach 24 Stunden Behandlung und in 100 % nach 48 Stunden Behandlung manifestiert.
I. Allgemeine Informationen
Der Test wurde im Zeitraum vom 7.11. bis 21.11.2023 an dem Referenzstamm Escherichia coli ATCC25922 (lactosefermentierend) durchgeführt. Zum Zählen der lebenden Zellen von E. coli wurde ein selektives und differenzielles Medium (MacConkey-Agar) verwendet. Dieses Medium enthält Komponenten, die das Wachstum grampositiver Bakterien hemmen (Kristallviolett, Gallensalze), sowie einen differenziellen Bestandteil (Lactose). Lactose-fermentierende (lactose-positive) Stämme von E. coli bilden nach 24 Stunden Inkubation rote bis rosafarbene Kolonien mit einem Durchmesser von 2–3 mm (Abb. 1).
Abb. 1. Wachstum von lactose-positiven Kolonien von Escherichia coli auf MacConkey-Agar. Ein Zehntel Milliliter der Salzlösungssuspension des getesteten Stammes wurde auf die Platte inokuliert.
II. Inokulation von Constructive Microbes auf MacConkey-Agar
Da Constructive Microbes aus einer Mischung lebender Zellen mehrerer Bakterienarten bestehen, wurde im ersten Schritt des Experiments die Flüssigkeit (in den Verdünnungen 1:10 und 1:100) auf MacConkey-Agar aufgebracht. Das Medium wurde aerob bei 30 °C für 48 Stunden inkubiert. Nach 24 Stunden Inkubation zeigte sich das Wachstum sehr zahlreicher, kleiner, lactose-negativer Kolonien (weniger als 0,5 mm Durchmesser, Abb. 2), sowie mäßig zahlreicher Kolonien von 1,5–2 mm Durchmesser (ebenfalls lactose-negativ). Es konnten keine lactose-positiven Kolonien auf dem Medium nachgewiesen werden. Somit konnte MacConkey-Agar in den weiteren Schritten des Experiments verwendet werden, und jeder Nachweis von lactose-positiven Kolonien würde ausschließlich auf das Vorhandensein lebender Zellen von Escherichia coli zurückzuführen sein, die der Flüssigkeit zugesetzt wurden.
Abb. 2. Wachstum von Bakterien aus Constructive Microbes auf MacConkey-Agar (Verdünnung 1:100, Inkubationszeit: 24 h). Es sind nur kleine, lactose-negative (farblose) Kolonien zu sehen.
III. Herstellung der E. coli-Suspension
Eine Kultur von E. coli, gewachsen auf Tryptic-Soy-Agar, wurde mit Kochsalzlösung vermischt, um eine Suspension entsprechend 0,5 des McFarland-Trübungsstandards zu erhalten. Anschließend wurde diese Suspension zur Bestimmung der Zellzahl 1:10.000 und 1:100.000 verdünnt, und jeweils 0,1 ml jeder Verdünnung auf eine Petrischale mit Tryptic-Soy-Agar überführt. Auf Grundlage der gewachsenen Kolonien wurde die Konzentration der E. coli-Zellen mit 5,4 × 10⁷/ml berechnet.
IV. Bewertung der Aktivität von Constructive Microbes gegen E. coli
Die zuvor hergestellte Suspension von E. coli (0,5 des McFarland-Standards) wurde im Verhältnis 1:1 mit der unverdünnten Flüssigkeit der Constructive Microbes vermischt (2 ml E. coli-Suspension + 2 ml Flüssigkeit) und bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 24 und 48 Stunden sowie nach 5 Tagen des Versuchs wurden jeweils 0,5 ml der Mischung in den Verdünnungen 1:10, 1:100 und 1:10.000 mit Kochsalzlösung hergestellt, und 0,05–0,1 ml jeder Verdünnung auf MacConkey-Agar inokuliert. Die Platten wurden anschließend 24 Stunden bei 37 °C inkubiert. Zu jedem untersuchten Zeitpunkt wurde die Zahl der lebenden E. coli-Zellen anhand der Anzahl der lactose-positiven Kolonien auf dem Medium berechnet. Zur Erhöhung der Zuverlässigkeit der Ergebnisse wurde das in den Punkten III und IV beschriebene Verfahren in doppelter Ausführung durchgeführt.
In der ersten Versuchsreihe zeigte sich bereits nach 24 Stunden Inkubation der E. coli-Suspension mit Constructive Microbes kein Wachstum. Auch nach 48 Stunden und nach 5 Tagen der Inkubation trat kein Wachstum auf. Somit inaktivierte die getestete Flüssigkeit 100 % der E. coli-Zellen bereits innerhalb von 24 Stunden.
Im wiederholten Experiment wurde nach 24 Stunden Inkubation der E. coli-Suspension mit Constructive Microbes kein Wachstum des Bakteriums in der Verdünnung 1:10 festgestellt, jedoch wurde in der Verdünnung 1:100 eine lactose-positive Kolonie nachgewiesen (Abb. 3). Dieser Befund könnte entweder durch die versehentliche Übertragung einer einzelnen E. coli-Zelle während der Herstellung der Verdünnungsreihe oder durch Kontaktinhibition des Mikroorganismus durch die stärker konzentrierte (d. h. 1:10) Constructive-Microbes-Flüssigkeit direkt auf der Mediumsoberfläche entstanden sein.
Selbst wenn das Vorhandensein einer einzelnen E. coli-Kolonie in der Verdünnung 1:100 kein Zufall wäre, entspräche die Zahl der lebenden Zellen des Mikroorganismus nach 24 Stunden Behandlung mit Constructive Microbes 2 × 10³, was einer Reduktion von 99,995 % der ursprünglichen Zellzahl entspricht.
Abb. 3. MacConkey-Agar inokuliert mit E. coli-Suspensionlactose-negative Kolonien zu sehen, während in der Verdünnung 1:100 eine lactose-positive Kolonie (typisch für E. colinnung 1:10 sind zahlreiche kleine, lactose-negative Kolonien zu sehen, während in der Verdünnung 1:100 eine lactose-positive Kolonie (typisch für E. coli) nachgewiesen wurde.